密度梯度离心是一种利用
离心力场的作用使
细胞分层、分离的技术。这种方法使用一种介质在离心管内形成连续或不连续的密度
梯度,然后将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部。常见的介质包括
氯化铯、
蔗糖和多聚蔗糖。
密度梯度离心的原理是基于不同颗粒之间的
沉降系数差异。在一定的离心力作用下,颗粒会以不同的速度沉降,最终在密度梯度的不同区域内形成区带。
区带离心法是一种将样品加入惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡的方法。这种技术能够将颗粒分配到梯度中特定的位置,从而形成不同的区带。区带离心法的优点在于分离效果好,能够一次性获得较为纯净的颗粒,并且适用于广泛的样品类型。然而,它的缺点是离心时间长,需要制备惰性
梯度介质溶液,并且操作过程严格,难以掌握。
差速区带离心法适用于分离具有一定
沉降系数差的颗粒,或者分子量相差三倍的
蛋白质。在这种方法中,离心管首先装有密度梯度介质溶液,样品液则添加在梯度介质的液面上。离心过程中,颗粒按照各自的沉降速度向下沉降,最终形成一系列清晰的不连续区带。这种方法的关键是选择适当的离心转速和时间。
等密度区带离心法则是通过离心形成梯度来分离样品颗粒。在这种方法中,样品颗粒会上浮至与其密度
相等的等密度点,形成多个不同的区带。等密度区带离心法的分离效率主要取决于样品颗粒的
浮力密度差,而不是颗粒的大小和形状。这种方法常用于分离
核酸、亚
细胞器以及复合
蛋白质。
为了确保密度
梯度离心的成功,使用的介质应具备以下特性:能够产生密度梯度,且随着密度增加,粘度不应显著升高;pH值接近中性或易于调整为中性;浓度较大时
渗透压不宜过高;并且对
细胞无毒性。