马祖毅1925年6月生于江苏省建湖县，自幼受到家庭的严格教育，六岁便开始在私塾学习1954年考入
复旦大学英文系，1958年毕业后，先后在芜湖师范学院、
合肥师范学院和
安徽大学担任教师。1949年后，他历任中共苏南区党委农村工作团团员，中共无锡市委工作组成员，安徽省高校外语系教师，安徽大学大洋洲文学研究室主任，研究员。安徽省第六届政协委员。1943年开始发表作品，1984年加入
中国作家协会。著有《中国翻译简史》《汉籍外译史》《皖诗玉屑》《澳大利亚文学作品中译本书目》，译著《面包树》《无期徒刑》（合译）《榕树叶子》（合译）《兔子归来》（合译）《芳丹马拉》等。《中国翻译简史》获1986年安徽省社会科学优秀成果
二等奖。
马祖毅的祖父
马为瑗是晚清时期的州县官，叔祖曾留学
早稻田大学。父亲马锡川（1901—1986），字鲁山，号小，中学毕业后考入唐山交大（今
西南交通大学），后来在建湖和
郑伯奇担任语文和历史老师，著有诗集《鲁山遗草》。马祖毅是
长房集团长孙，家中对教育格外重视。他在上世纪80年代出版的《中国翻译简史——“五四”以前部分》开创了我国翻译史研究的先河。1996年离休后，马教授继续笔耕不辍，相继推出《汉籍外译史》《
中国翻译史》（上卷）和五卷本《中国翻译通史》三部专著。其中，2006年出版的五卷本《中国翻译通史》以四百万言系统梳理了中国三千年译史，勾勒出中国翻译活动发展脉络，并将史上重要译家及其翻译理论进行整理评析，为中国翻译史研究做出了贡献，对翻译学科发展具有指导意义。
马祖毅五岁开始背诵《诗经·国风》和
唐诗绝句，六岁正式入私塾，先后跟四位塾师学习。第一位塾师是其三
伯父马锡赞，早年留学
法国，虽未有成就但教几个蒙童绰绰有余。第二位塾师是位老夫子，晚清曾应考科举，会写铿锵的八股文，教读《左传》。第三位塾师是其父亲马锡川，1938年被迫辍学回家，父亲亲自在家教。父亲不但要马祖毅学习
文言文，还要学白话文，读书写字要用两种文体同时进行。此外，父亲还专门为他选定了两种课外读物：一是
梁启超的两卷本《
饮冰室文集》，还有一种是
上海市出版的《
小朋友》杂志。最后一位塾师叫薛宗元，因为擅写旧体诗而闻名乡里，人称“才子”。父亲对马祖毅日后作诗、译诗影响很大。
1945年，马祖毅被东吴大学附属中学录取，1954年考入
复旦大学。