佐伯惟定，幼名太郎，大友氏家臣梅牟礼城主佐伯惟直的嫡子，在祖父惟教与父亲惟直、叔父镇忠在耳川之战中一同讨死后，

继任为第十七代家督，自天正七年起，倚梅牟礼城不断与北上的岛津军对抗。

天正十四年，在岛津家迫降失去英主龙造寺隆信的龙造寺家后，一方面由肥后北上蚕食大友领地，另一方面则让四弟岛津家久统率大军从日向往丰后攻打，同时岛津义久大量驱使谋略以所领安堵的条件大规模地对大友家旗下诸将进行内应工作。眼见大友家大势已去的入田义实首先与岛津义久内通，之后南山城主志贺鉴隆、久住町的麻生绍和、朝日岳城守将柴田绍安相继传出成为岛津军内应的消息。除此之外，松牟礼城主田北镇利、鸟屋城一万田镇实、山野城的朽网鉴康、镇则不但在面对岛津军时直接降伏更进一步将岛津家的势力引入筑后一带。

在四周的友军一个接一个倒向岛津方后，岛津家久劝降的使者也来到了梅牟礼城。佐伯惟定不但坚拒了使者的劝降，还将使者当场斩杀，本来两军交锋，不斩来使，佐伯惟定这番无礼的举动正是要表明自己誓死对抗的决心和意志。在击退了来袭的岛津军之后，佐伯惟定与甫突破新纳忠元包围的冈城城主志贺亲次一同展开炽烈的反击，将当初被岛津家寝返的南郡诸城逐步夺回大友家，使大友家得到更多的喘息空间，支持到丰臣秀吉出阵。天正十五年正月，丰臣秀吉正式开始进行九州讨伐，期间大为活跃的佐伯惟定在得到秀吉所赐的感状后随秀长军反攻，再立战功。

文禄元年，丰臣秀吉发起朝鲜侵略，佐伯惟定做为大友军的一员从军参阵，不料主公大友义统翌年在朝鲜战场上得知敌方大军来袭的消息后，居然立刻自前线逃跑，引起秀吉大怒，因此遭到改易处份，佐伯惟定因是大友家臣而亦遭到牵连不得不离开佐伯氏已经居住了四百年的故乡下野，后来羽柴秀保赏识惟定昔日武勋将他推荐给笔头家老藤堂高虎担任其麾下的侍大将，在高虎入国伊予宇和岛得到七万石的封地时佐伯惟定也从高虎处拜领了两千石的俸禄，再次投入朝鲜战场，佐伯惟定已成为藤堂军的其中之一。

在秀吉死后，于庆长五年石田三成与德川家康展开决定天下谁属的关原会战，主君藤堂高虎因为素与家康修好而投入东军，是役之中佐伯惟定并未参战而是被任命伊予板岛城留守居役的职务，战后藤堂高虎被转封至伊势津城，此后十年间身为藤堂藩士之一的佐伯惟定主要负责领内的各城的普请职务。

关原合战后，德川家康开创江户幕府，身任征夷大将军，随后又把将军之位让于世子德川秀忠，称大御所。但是他心中仍然有一块阴影，就是居于大阪城中的丰臣秀赖，于是他费尽苦心方硬借方广寺钟铭的事件挑起大坂之役。在夏之阵中佐伯惟定与藤堂高吉一同担任先锋在八尾合战中与长宗我部盛亲交战，率先以铁炮攻击射杀了盛亲的先锋大将吉田内匠，但是在盛亲熟的指挥下，长宗我部军于长濑川堤防上布阵反击，反倒痛击藤堂军，令高虎失去藤堂高刑、藤堂氏胜、桑名一孝等武将，佐伯惟定和藤堂高吉在攻破盛亲的先锋军火速回援方缓住盛亲的猛攻，直到井伊直孝来援才逼退长宗我部军，但藤堂高虎军同样是损失惨重，折损了部将六人、队长七十一人、三百馀名兵士战死，元气大伤。

由于前日和长宗我部盛亲的交战中藤堂军受到重创，因此辞退了翌日在天王寺的最终决战里先锋之职，但佐伯惟定和藤堂高吉还是担任藤堂军的先锋，战后因功增加五百石，总共领有四千五百石的知行领位列藤堂藩的重臣之一。

元和四年，佐伯惟定逝世，享年五十岁，法名宗忠功月大禅定门。