双缩法是一个用于鉴定
蛋白质的分析方法。
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%
氢氧化钾、几滴1%
硫酸铜和
酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时（
多肽），试液中的铜与多肽配位，
配位化合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱，如
氢氧化钠所代替。向试剂中加入
碘化钾，可延长试剂的使用寿命。
双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，
双缩脲与二价铜离子形成紫色
配位化合物，称为
双缩脲反应。凡具有两个
酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与
蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有：
硫酸铵、
乙酰丙酮铁缓冲液和某些氨基酸等。
1. 试剂：
1.
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶
牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准
蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N
氢氧化钠配制。
（2）
双缩脲试剂：称以1.50克
硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克
酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以
石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2. 器材：
1.
2. 器材：
1.
标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准
蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升
双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。