羟化酶（hydroxylase），亦称为氢氧化酶、羟基化酶，是加氧酶的一种，催化利用氧分子形成氢氧化物（酚、醇）反应的酶，多以氧气为氧源。

羟化酶（hydroxylase）所谓单（加）氧酶，除底物外，还需要还原剂（NADP-H）。化学反应式为：AH+O2+NADPH+H+→AOH+NADP++H2O。在从L-苯丙氨酸合成酪氨酸（苯丙氨酸羟化酶），从苯胺合成氨基苯酚（芳基4-羟化酶），从鲨烯（三十碳六烯squalene）合成类固醇（鲨烯羟化酶）以及进行类固醇的羟基化（各种类固醇羟化酶）等的反应中，都存在着羟化酶。在羟化酶中，多数以 P-450或F-AD等作为组成成分。在多数情况下，它存在于各种脏器微粒体。在副肾皮质的线粒体中也有存在。

羟化酶的例子包括但不限于以下几种：

- 17α羟化酶

- 胆固醇7α-羟化酶

- 多巴胺β羟化酶：催化多巴胺转化为去甲盐酸肾上腺素

- 苯丙氨酸羟化酶：催化苯丙氨酸转化为酪氨酸

- 酪氨酸羟化酶：催化酪氨酸转化为左旋多巴

- 色氨酸羟化酶：催化色氨酸转化为5-羟色氨酸

这些酶在生物体内的代谢途径中扮演着关键角色，参与了多种重要生物合成过程。