ELISA（酶联免疫吸附试验，酶联免疫试剂盒）是一种广泛应用于多种疾病诊断的免疫测定技术。该技术利用酶的催化作用和抗原抗体的特异性结合，实现了快速、敏感、简便的检测。

ELISA试剂盒的种类丰富多样，涵盖了自身免疫检测试剂盒、细胞因子ELISA试剂盒、流式细胞仪用试剂类、天然橡胶手工及上机试剂、内分泌检测试剂盒、肿瘤标记物检测试剂、微生物传染病检测试剂等多种类别。此外，还包括实验室仪器类、PCR及相关试剂、肝纤维化检测、单克隆抗体、ELISPOT、特种蛋白、微色谱柱、优生优育TORCH、生化试剂、抗体、细胞株以及其他分子生物学研究用试剂。

ELISA试剂盒的使用涉及样本的采集和处理。标本必须为液体，不含沉淀，包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等。每个标本量收集体积=100ul×检测种类。样品采集前应了解待检测成份的稳定性。对于需要周期收集的标本，应将其及时分装并在-20℃或-70℃条件下保存，避免反复冻融。标本2-8℃可保存48小时，-20℃可保存1个月，-70度可保存6个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。

ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此类结合不影响酶的生物学活性，也不会改变抗体的免疫学特性。酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下发生颜色变化，颜色的深浅与标本中相应抗体或抗原的量成正比。因此，可通过底物的颜色反应来判断是否存在相应的免疫反应。

ELISA中常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。其中，HRP因其高度的活性和敏感性而最为常见。HRP的底物种类多样，常用的是1，2-苯二胺（OPD），其产物为橙色，可溶性高，敏感性高，最大吸收值在490nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。

良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。

测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。酶与抗体的活性常用琼脂扩散或免疫电泳法测定，使抗原与抗体形成沉淀线，经pbs漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。

根据ELISA所用的固相载体的不同，试剂盒可分为三大类型：聚苯乙烯微量板为载体的ELISA（微量板ELISA）、硝酸纤维膜为载体的斑点ELISA（Dot-ELISA）以及采用疏水性聚脂布作为载体的布ELISA（C－ELISA）。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。

本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎（DVH）抗体的ELISA为例，间接ELISA的操作程序如下：

1. 加抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

2. 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

3. 加酶标抗体 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

4. 加底物液 → 37℃ 30分钟，加终止液

5. 用ELISA检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。

本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡鸡传染性囊病病毒（IBDV）的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序：

1. 加抗体（Ab-1）包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

2. 加待检抗原（Ag） → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

3. 加酶标抗体（ab3）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

4. 加底物液 → 37℃ 15分钟，加终止液

5. 用ELISA检测仪测定OD值。

此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提高试验的敏感性。此法的基本程序为：

1. 加抗体（Ab-1）包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

2. 加待检抗原（Ag） → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

3. 加用非同种动物生产的特异性抗体（Ab-2）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

4. 加入酶标抗ab2抗体（AB-3）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

5. 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

6. 用ELISA检测仪测定OD值。

此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。其基本程序为：

1. 抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

2. 加入待检抗原及一定量的酶标抗原（对照孔仅加酶标抗原）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

3. 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

4. 用ELISA检测仪测定OD值。

本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序：

1. 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

2. 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

3. 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

4. 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

5. 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

6. 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

7. 用ELISA检测仪测定OD值。

本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期，所以检测出IgM，则可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种，其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性，该方法的主要程序为：

1. 用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干

2. 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

3. 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

4. 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

5. 用ELISA检测仪测定OD值。

与常规的微量板ELISA比较，Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：

1. 载体膜的预处理及抗原包被 取硝化纤维素膜用蒸馏水浸泡后，稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥。每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40－53个样品，每个压圈可加抗原液1－20μl。

2. 封闭 将硝酸纤维素膜置于封闭液中，37℃感作15－30分钟。封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的pbs。

3. 加被检血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量适度稀释的待检血清，37℃反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次1－3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。

4. 加酶标抗体，37℃反应一定时间后，用洗涤液洗三次。

5. 显色加入新鲜配制的底物液，37℃反应一定时间后，去掉底物液，加蒸馏水洗涤终止反应。

6. 结果判定 以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应。

C－ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大学者Blais, B. W.等于1989年建立的一种新型免疫检测技术。该方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即涤纶布为固相载体，这种大孔径的的疏水布具有吸附样品量大，可为免疫反应提供较大的表面积，提高反应的敏感性，且容易洗涤，不需特殊仪器等优点。其基本原理与Dot-ELISA类似，只是载体不同。以对布氏杆菌抗原的检测为例，C－ELISA的主要程序为：

1. 首先把抗布氏杆菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并经洗涤及封闭；

2. 加被检样品并于室温下感作30分钟，然后洗5次；

3. 加酶标记的抗布氏杆菌抗体，于室温下感作30分钟，然后洗涤5次；

4. 加入底物液显色；

5. 利用酶标仪测定OD值。

可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清作为检测标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只需待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。

按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。

温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。

保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA?是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既是疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。

洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过程如下：

（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。

（2）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。