双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一项进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。

目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点（spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.

样品制备（sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing）样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients）胶上的转换.三丁基膦（Tributyl phosphine，TBP）取代β-2-巯基乙醇或二硫苏糖醇完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加]. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸（脱氧核糖核酸). 除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎]等. 另外，添加苯甲基磺酰氟等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失]. 此外，低丰度蛋白（low abundance protein）在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战.亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量（已达到1～15 mg级的标准）、应用敏感性检测，可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹（MI-2DE）是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白（basic proteins）的分离是另一难点. 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流（EOF）的产生，对PI（等电点）超过10的碱性蛋白，通过产生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的2-丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.

2-DE面临的挑战是高分辨率和重复性. 高分辨率确保蛋白最大程度的分离，高重复性允许进行凝胶间配比（match). 对2-DE而言，有3种方法分离蛋白：1）ISO-DALT(isoelectric focus）以O’Farrell’s技术为基础. 第一向应用载体两性电解质（carrier ampholyte,CA），在管胶内建立pH梯度. 随着聚焦时间的延长，pH梯度不稳，易产生阳极漂移. 2） NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis）用于分离碱性蛋白（pH\u003e7.0). 如果聚焦达到平衡状态，碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失. 因此，在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成，但很难控制. 3）IPG-DALT发展于80年代早期. 由于固相pH梯度（Immobilized pH gradient,IPG）的出现解决了pH梯度不稳的问题. IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度，克服了IEF的缺点，从而达到高度的重复性. 目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线，范围或宽或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3～5或碱性pH 6～11的IPG凝胶梯度联合商品化的pH 4～7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群（proteomic contigs）从而有效分离.

分离后的斑点检测（spot detection）亦很重要. 所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术。银染已成为一种检测2-DE的流行方法，可检测少到2～5ng的蛋白，因此较考马斯亮蓝R-250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，一些有机染料不适于PVDF膜。放射性标记不依赖其代谢的活性，并仅适于对合成的蛋白质检测. 另有一种改良的2-DE（差异凝胶电泳），即应用两种不同的染料荧光标记两个样品，使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个，避免了几种2-DE的比较，可在纳克级进行检测.

较早期相比，2-DE有两个主要的进步：首先，极高的重复性使有机体的参考图谱，可通过Internet获得，来比较不同组织类型、不同状态的基因表达；其次，高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.

重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？

一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。

为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？

通常情况下，等点聚焦中体系内除了蛋白质还会存在少量带电小分子，当这些带电小分子在电场中向两极运动时，会带动胶条中的水分子运动，水分子运动会带动附近的覆盖油移动，当样品质量不高，带电小分子较多时，会导致覆盖油移动严重溢出胶条槽，此时，通常会伴随胶条的酸性端胶条厚度增加。当发生覆盖油溢出或胶条暴露时，应及时补加覆盖油。为了防止这个现象的发生，应从样品制备时严格控制样品质量，尽量减少带电小分子如盐离子的含量。同时可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（80 %满）的覆盖油。

跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压（50 μ A/ 胶）？

电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，修饰蛋白，从而对等电聚焦产生影响。

跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？

刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动，而蛋白质运动需要较高的电压。

跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？

蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。

跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？

当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。

跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？

当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。

跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？

等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中性分子。这时加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。

重泡胀缓冲液（rehydration buffer）中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？

硫的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。

怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值？

可以根据胶条的pH范围和长度估算蛋白质点的pI值，在第二向中加入分子量Marker估算蛋白质点分子量。也可以用体系内已知蛋白来做比对。

为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？

横的脱尾可能是：1）一向等电聚焦不完全； 2）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）； 3）蛋白的丰度太高。竖的脱尾可能是1）平衡时碘乙酰胺量不足；2）跑二向时，蛋白的溶解度不好。

什么成分会影响 2D 胶的效果？

核酸，盐，去垢剂等等。

2D 胶的上样量应该在什么范围？

上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在 100 微克（银染）到 500 微克（考染）之间。

我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？

蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。另外超滤对样品的要求比较高。丙三醇，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。沉淀法中，又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境（不含盐，丙三醇，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。

第一向等电聚焦

⒈ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含二硫苏糖醇，不含IPG buffer）一小管（1ml/管），置室温溶解。

⒉ 在小管中加入0.01g DTT， 0.5% 对应胶条pH范围的IPG buffer，充分混匀。

⒊ 从小管中取出400微升水化上样缓冲液，加入100微升样品（考马斯亮蓝染色需样品1mg，银染需300μg），充分混匀。

⒋ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟。

⒌ 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。

⒍ 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

⒎ 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。

⒏ 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

⒐ 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。

⒑聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

第二向SDS-PAGE电泳

⒈ 装配灌胶模具，配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配200ml凝胶溶液，每块凝胶50ml，将溶液沿灌胶模具背面槽道倒入，直至溶液到距离玻璃板1cm停止，用75%乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟后，凝胶与上方液体分层，表明凝胶已基本聚合，建议聚合3-5h使凝胶完全聚合。

⒉ 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。

⒊ 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其恢复至室温。

⒋ 配制胶条平衡缓冲液I（含DTT）。

5．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

⒍ 将胶条转移至平衡管或溶胀盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5-10ml胶条平衡缓冲液I。将平衡管或溶胀盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

⒎ 配制胶条平衡缓冲液Ⅱ（含碘乙酰胺）。

⒏ 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

⒐ 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。

⒑将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解。

⒒将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。

⒓第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅱ。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。

⒔将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。

⒕将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

⒖用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。

⒗放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

⒘在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。

⒙在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低功率（1W/gel/18-24cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（13-15W/gel/18-24cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

⒚电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。

⒛进行染色。

1、样品新鲜。

说明：组织样本及细胞采样后应立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂，运输过程中血液、血清样品4℃保存，其它样品-20℃保存，不超过48小时（若外地邮寄，除血液、血清及细胞外请用干冰）。

2、样品蛋白的总量不少于1mg。

说明：组织样本每份约250-500mg；

细胞样品每份106—107细胞数（一块胶）；

血液、血清等样品大于5mL，且不能溶血性贫血；

蛋白提取物要求蛋白浓度大于5mg/mL，总量不少于1mg，且均匀无沉淀，样品中无盐成分；

植物或真菌样品量湿重不少于2g；

富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于3g 。